1.目的：GMP潔凈區(qū)沉降菌測(cè)試方法及測(cè)試記錄表 闡述潔凈室空氣中沉降菌檢測(cè)操作規(guī)程，保證藥品質(zhì)量，防止生產(chǎn)環(huán)境對(duì)產(chǎn)品的污染。

2.范圍：適用于本公司潔凈區(qū)(室)的沉降菌的監(jiān)測(cè)。

3.責(zé)任：沉降菌檢測(cè)員。

4.內(nèi)容：GMP潔凈區(qū)沉降菌測(cè)試方法及測(cè)試記錄表

4.1基本概念：

4.1.1菌落:**培養(yǎng)后,由一個(gè)或幾個(gè)**繁殖而形成的一**集落,簡(jiǎn)稱CFU.通常用個(gè)數(shù)表示。

4.1.2沉降菌：用GB/T16292-2010提及的方法收集空氣中的活性微生物粒子，通過(guò)專門的培養(yǎng)基在適宜的生長(zhǎng)條件下繁殖到可見(jiàn)的菌落數(shù)。

4.1.3沉降菌菌落數(shù):規(guī)定時(shí)間內(nèi)每個(gè)平板培養(yǎng)皿收集到空氣中沉降菌的數(shù)目，以個(gè)/皿表示。

4.2測(cè)試原理:本測(cè)試方法利用沉降法，即通過(guò)自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養(yǎng)基平皿，經(jīng)若干時(shí)間，在適宜的條件下讓其繁殖到可見(jiàn)的菌落數(shù)，以平板培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)來(lái)評(píng)定潔凈環(huán)境內(nèi)的活微生物數(shù)，并以此來(lái)評(píng)定潔凈區(qū)的潔凈度。

4.3測(cè)試方法：

4.3.1使用的儀器設(shè)備和培養(yǎng)基:

    高壓**鍋:使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行。

    恒溫培養(yǎng)箱:必須定期對(duì)培養(yǎng)箱的溫度計(jì)進(jìn)行檢定。

    培養(yǎng)皿:一般采用φ90mm×15mm硼硅酸玻璃培養(yǎng)皿。使用前將培養(yǎng)皿置于121℃濕熱**20min。

    培養(yǎng)基:胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。

將培養(yǎng)基加熱熔化，冷卻至約45℃在無(wú)菌操作條件下將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿，每皿約15ml。待瓊脂培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)基平皿放入32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)若培養(yǎng)基平皿上確無(wú)菌落生長(zhǎng)即可供采樣用，制備好的培養(yǎng)基平皿應(yīng)在2-8℃的壞境中存放。

4.3.2測(cè)試時(shí)間:

    對(duì)單向流，如A級(jí)凈化房間內(nèi)及層流工作臺(tái)，測(cè)試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于10分鐘后開(kāi)始。

    對(duì)非單向流，如B級(jí)、C級(jí)、D級(jí)以上的凈化房間，測(cè)試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于30分鐘開(kāi)始。

4.3.3采樣點(diǎn)數(shù)目及其布置:

采樣點(diǎn)數(shù)目下限值:沉降菌的采樣點(diǎn)數(shù)下限值可按表1確定。在滿足*少測(cè)點(diǎn)數(shù)的同時(shí)，不宜滿足*少培養(yǎng)皿數(shù)，見(jiàn)表2

表1 采樣點(diǎn)數(shù)下限值

面積（m2）	潔凈度等級(jí)
	A、B級(jí)	C級(jí)	D級(jí)
＜10	2-3	2	2
≥10-＜20	4	2	2
≥20-＜40	8	2	2
≥40-＜100	16	4	2
≥100-＜200	40	10	3
注：表中的面積，對(duì)于單向流潔凈室，指的是送風(fēng)面積，對(duì)于非單向流潔凈室，指的是房間面積。

表2 培養(yǎng)皿數(shù)下限值

潔凈度等級(jí)	所需φ90mm培養(yǎng)皿數(shù)（以沉降4h計(jì)）
A	14
B	2
C	2
D	2

    采樣點(diǎn)的布置:

    除受潔凈區(qū)的設(shè)備限制外，取樣點(diǎn)應(yīng)在整個(gè)潔凈區(qū)均勻布置。

    在日常監(jiān)控時(shí)，那些與產(chǎn)品相鄰近的區(qū)域，以及可能與產(chǎn)品直接接觸的空氣及設(shè)備附近應(yīng)考慮增加取樣點(diǎn)和取樣次數(shù)(與產(chǎn)品非接觸區(qū)相比，這些區(qū)域應(yīng)視為關(guān)鍵區(qū)):人員活動(dòng)頻繁或人員較集中的區(qū)域也應(yīng)視為關(guān)鍵區(qū)，需加強(qiáng)監(jiān)控。

    取樣點(diǎn)一股布置在趾離地面0.8-1.0m之間或操作平臺(tái)的高度。

    取樣時(shí)，取樣沒(méi)備會(huì)對(duì)氣流產(chǎn)生干擾，取樣時(shí)應(yīng)避免可能對(duì)氣流組織的干擾。

    盡量避免在回風(fēng)口附近取樣(距離lm以上)，且測(cè)試人員應(yīng)在取樣口的下風(fēng)側(cè)，并盡量少走動(dòng)。

4.3.4測(cè)試步驟：

4.3.4.1采樣方法:

    用無(wú)菌容器(如不銹鋼儲(chǔ)槽)將預(yù)先培養(yǎng)的培養(yǎng)皿(無(wú)菌平皿)帶至待測(cè)區(qū)，將培養(yǎng)皿取出，放置在預(yù)先確定取樣點(diǎn)，打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.5小時(shí)，再將培養(yǎng)皿蓋上，蓋后倒置。檢測(cè)時(shí)記下培養(yǎng)皿打開(kāi)的起始時(shí)間和結(jié)束時(shí)間。

4.3.4.2培養(yǎng)：

全部采樣結(jié)束，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。32℃培養(yǎng)，時(shí)間為72小時(shí)。

每批培養(yǎng)基應(yīng)有對(duì)照試驗(yàn)，檢查培養(yǎng)基本身是否污染，可每批選定三個(gè)培養(yǎng)皿做對(duì)照培養(yǎng)。

4.3.4.3菌落計(jì)數(shù):

    用肉眼直接計(jì)數(shù)，然后用5-10倍放大鏡檢查，是否有遺漏。若培養(yǎng)皿上有2個(gè)或2個(gè)以上菌落重疊，可分辨時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上計(jì)數(shù)。

4.3.5注意事項(xiàng)：

    測(cè)試用具要做**處理，以確保測(cè)試的可靠性、正確性。

    采取一切措施防止人為對(duì)樣本的污染。

    對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)的記錄。

由于**種類繁多，差別甚大，計(jì)數(shù)時(shí)一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察，不要漏計(jì)培養(yǎng)皿邊緣生長(zhǎng)的菌落，必要時(shí)用顯微鏡鑒別。

    采樣前應(yīng)仔細(xì)檢查每個(gè)培養(yǎng)皿的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)、破損或污染的應(yīng)剔除。

測(cè)試狀態(tài):

    沉降菌測(cè)試前，被測(cè)試潔凈區(qū)的溫濕度須達(dá)到規(guī)定的要求，靜壓差必須控制在規(guī)定值內(nèi)。

    沉降菌測(cè)試前，被測(cè)試潔凈區(qū)己經(jīng)過(guò)**。

    測(cè)試狀態(tài)有靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種，在空調(diào)系統(tǒng)驗(yàn)流時(shí)、長(zhǎng)期停產(chǎn)恢復(fù)生產(chǎn)前、設(shè)施設(shè)備大修復(fù)產(chǎn)前進(jìn)行靜態(tài)測(cè)試，在日常監(jiān)測(cè)時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

    測(cè)試人員:測(cè)試人員必須穿戴符合環(huán)境級(jí)別的工作服。靜態(tài)測(cè)試時(shí)，室內(nèi)測(cè)試人員不得多于2個(gè)人。

結(jié)果計(jì)算:

用計(jì)數(shù)方法得出各個(gè)培養(yǎng)皿的菌落數(shù)。

平均菌落數(shù)的汁算見(jiàn)下式:

計(jì)算公式：

M =（M1+M2+…+MN）/n

 

式中M為平均菌落數(shù)（CFU）

Mi表示1，2，3，……n號(hào)平皿菌落數(shù)；n表示平皿總數(shù)。

6．標(biāo)準(zhǔn)：

潔凈度級(jí)別	沉降菌平均菌落數(shù)（CFU/皿）以4h計(jì)
A	＜1
B	5
C	50
D	100

7.結(jié)果評(píng)定:

    用平均菌落數(shù)判斷潔凈室的空氣中的微生物。

    潔凈區(qū)內(nèi)的平均菌落數(shù)必須符合所選定的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。

    若某潔凈區(qū)的菌落數(shù)超過(guò)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，則必須對(duì)此區(qū)域先行**，然后重新測(cè)試兩次，測(cè)試結(jié)果必須合格。

8.偏差糾正

    一旦發(fā)現(xiàn)空氣微生物監(jiān)測(cè)結(jié)果超標(biāo)，一般可以采取以下行動(dòng)進(jìn)行調(diào)查和評(píng)估:

 

GMP潔凈區(qū)沉降菌測(cè)試方法及測(cè)試記錄表

 

測(cè)試依據(jù)

GB/T16294-2010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室懸浮粒子的測(cè)試方法，衛(wèi)生部《中國(guó)生物制品規(guī)程》制定

測(cè)試狀態(tài)

□ 靜態(tài)  □ 動(dòng)態(tài)

其他測(cè)試合格情況

溫濕度:     壓差:       換氣次數(shù):

操作方法

1、  采用平板暴露法： 靜態(tài)將姨酪大豆胨瓊脂平板（9cm直徑）要求及采樣點(diǎn)平面圖逐個(gè)放置，打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表暴露30分鐘后，將培養(yǎng)基皿蓋上后倒置。 動(dòng)態(tài)：將姨酪大豆胨瓊脂平板（9cm直徑）要求及采樣點(diǎn)平面圖逐個(gè)放置，然后從里到外逐個(gè)打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露在空氣中4h后，將培養(yǎng)基皿蓋上后倒置。 2、全部采樣結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 3、在30℃—35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時(shí)間不少于48小時(shí)。 4、每批培養(yǎng)基應(yīng)有對(duì)照試驗(yàn)，檢驗(yàn)培養(yǎng)基本身是否污染。每批選定3只培養(yǎng)基作空白對(duì)照培養(yǎng)。

檢測(cè)點(diǎn)分布及編號(hào)

陽(yáng)性對(duì)照室二更

S1

S2

陰性對(duì)照室二更

S9

S10

微生物限度室

S17

S18

陰性對(duì)照

陽(yáng)性手消間

S3

S4

陰性手消間

S11

S12

微生物限度室工作臺(tái)

S19

S20

陽(yáng)性對(duì)照室

S5

S6

無(wú)菌室

S13

S14

1#

2#

3#

生物安全柜

S7

S8

無(wú)菌室工作臺(tái)

S15

S16

潔凈度級(jí)別

D級(jí)

C級(jí)

B級(jí)

A級(jí)

判定標(biāo)準(zhǔn)

≤100個(gè)/皿

≤50個(gè)/皿

≤5個(gè)/皿

≤1個(gè)/皿

培養(yǎng)溫度℃培養(yǎng)時(shí)間月       日      時(shí)至     月       日      時(shí) 測(cè)試點(diǎn)名稱陽(yáng)性對(duì)照室二更陽(yáng)性手消間陽(yáng)性對(duì)照室生物安全柜陰性對(duì)照室二更陰性手消間 測(cè)試點(diǎn)S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12 培養(yǎng)后菌落數(shù)(個(gè))             平均菌落數(shù)（個(gè)/皿）       結(jié)果判定       測(cè)試點(diǎn)名稱無(wú)菌室無(wú)菌室工作臺(tái)微生物限度室微生物限度室工作臺(tái)陰性對(duì)照 測(cè)試點(diǎn)S13S14S15S16S17S18S19S201#2#3#培養(yǎng)后菌落數(shù)(個(gè))           平均菌落數(shù)（個(gè)/皿）      結(jié)果判定

結(jié)論

經(jīng)測(cè)試，潔凈區(qū)沉降菌測(cè)試結(jié)果：

檢驗(yàn)

日期

復(fù)核

日期