空氣微生物可以吸附在細小的顆粒物表面，從而較長時間停留在空中，形成灰霾天氣。到目前為止，空氣微生物的研究已有約180 年的歷史［9］。1983 年，Jones 等［10］發現空氣微生物能夠導致人類、動物和植物疾病的傳播，威脅人健康。1997 年，Fuzzi 等［11］進一步發現了空氣微生物具有代謝活性。在國內，謝淑敏［12］和張素琴［13］等基于傳統的培養方法對京津地區的空氣微生物進行了初步研究。近年來，隨著高通量測序技術的出現，其通量大、速度快等優點，顯著提高了空氣微生物的研究深度。2009 年，Bowers 等［14］首次利用454 高通量測序技術對美國科羅拉多西北部一個高海拔地點的空氣微生物群落進行了研究。細菌是空氣微生物的主要組成部分，在空氣中廣泛存在且豐度高［15-16］，其中，少部分細菌是潛在致病菌，是造成醫院感染的重要因素［17］，成為空氣微生物研究的焦點。因此，本文綜述空氣微生物的采樣方法和群落解析方法，并對其中細菌群落的研究進展進行重點綜述，以期為空氣微生物污染的控制及有針對性地制定相關治理措施提供論依據。1 空氣微生物的采樣方法微生物采樣方法的選擇是研究空氣微生物群落的第一步。目前，關于空氣微生物的采樣并沒有統一的標準。空氣微生物的采樣方法較多，不同采樣器各具優缺點，主要依據研目的選擇合適的采樣方法。除此之外，在選擇采樣器的候還需考慮以下關鍵因素，如采樣效率、采樣靈敏度、操作的方便性、微生物的存活率、不同粒徑的區分及價格等。總的來說，空氣微生物的采樣可以分為四大類，即慣性撞擊類、過濾阻留類、靜電沉著類和溫差迫降類，其中前兩類用的較多［18-20］。圖1 空氣微生物采樣方法Fig． 1 Sampling methods f airborne microorganisms圖1 對不同采樣方式的特點進行了比較［18-20］。慣性撞擊類主要分為自然沉降法、射流撞擊式采樣和離心撞擊式采樣。其中，自然沉降法是最簡單、成本低的方法，主要利用重力沉降的作用收集空氣微生物顆粒，但是由于空氣流量未知，不能用于定量測定。射流撞擊式采樣器，可分為固體撞擊式采樣器和液體撞擊式采樣器。這類采樣器主要利用抽氣裝置以恒定的空氣流量采集顆粒物，可以用于空氣微生物的定量測定。固體撞擊式采樣器流量的變化范圍為10 ～ 700 L/min;而液體撞擊式采樣器的流量較小，一般在12 ～ 20 L/min，其用于高濃度的空氣微生物采樣，可測定空氣中活性微生物的數量，但是不適于低溫和長時間采樣。離心撞擊式采樣器結構簡單、體積小，對于細菌、真菌和病毒的捕獲效率較高，但其有效采氣量未知，也不能用作定量測定。過濾阻留類采樣利用抽氣裝置，使空氣微生物顆粒被截留在不同的濾材上，可以分為深層過濾和膜式過濾兩類，前者的濾材為纖維型或顆粒型濾料，后者是可溶性或不溶性的濾膜。這類采樣器可在低溫下進行采樣，采集效率高，能夠實現其基本原理是通過將空氣微生物采集到特定的采樣介質上，經過培養繁殖生長成菌落后計數，然后進行分離和純化，結合微生的形態構成、生理生化特征等實現對物種的分類鑒定［22］。在早期的研究中，國外一些研究學者使用傳統培養方法研究空氣微生物，如Lindemann［23］、Lighthart［24Shaffer［25］等。20世紀90 年代，國內相關研究逐漸興起，相關的研究人員有胡慶軒［26］、方志國［27］、謝淑敏［12］、凌琪［28］等。傳統的培養方法對于空氣微生物的研究是一個很好的方法，夠為世界范圍內空氣微生物基礎數據的儲備提供基礎。同時，傳統的培養方法可以用來分離微生物菌株，是研究細菌生理和代謝特性等方面信息的最直接有效的方法［19，21，29-30］。但是，由于活的可培養的微生物占所有微生物的比例不超過1%［29］，大部分微生物是不能被培養的，采用傳統的培養方法得到的微生物群落分布的信息極其有限，常會低估空氣微生物的多樣性，導致大量重要微生物被忽略或遺漏。與傳統的培養方法相比，非培養的方法基于基因組DNA，能夠較全面分析空氣微生物的群落組成，提高了研究的廣度和深度。隨著研究的深入，非培養的方法分為傳統的分子物學技術和高通量測序技術兩大類。傳統的分子生物學技術主要包括聚合酶鏈式反應( Polymerase Chain Reaction，PCR) ［31］、變性梯度凝膠電泳技術( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE) ［31］、末端限制性酶切片長度多態性分析( Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T －RFLP) ［32］和克隆( Clone) 文庫［33］等。近年來，這些技術已越來越多用于空氣微生物多樣性的研究中。Li 等［34］利用PCR－ DGGE 研究了近地面和高海拔采集的TSP 樣品中細菌群落的差異。Lee 等［32］利用T － RFLP 對首爾空氣中細菌和真菌的群落結構進行了研究。Jeon 等［35］利用克隆和DGGE 手段研究了亞洲沙塵對于空氣細菌群落的影響。但是，這些技術流程復雜，費時費力，通量低，測序成本高，在研究空氣微生群落方面存在一定的局限性。高通量測序技術的出現，大大高了環境微生物研究的深度。該技術具有數據產出通量高、價格便宜、速度快等特點［36］。目前，高通量測序技術以Roche公司的454、Illumina公司的Solexa 和Life Technologies 公司的SOLiD、Ion Torrent等為主［36］。454 測序是以DNA 乳膠擴增系統和焦磷酸為測序的基礎，因此，也被稱為“焦磷酸測序”［36］。Illunima 公司的HiSeq 和MiSeq 測序平臺是基于Solexa 技術開發的，其特有的可逆終止子設計，減少了堿基的重復摻入，保證了測序的準確性［36］。目前，454 和Illumina 測序技術在研究空氣微生物群落組成方面的應用最為廣泛。Bowers 等［37］利用454 測序技術對美國中西部4 個城市夏季和冬季近地面PM2. 5樣品中的細菌群落結構進行了研究。Robertson 等［38］利用454 測序技術對美國紐約城市地鐵中的生物氣溶膠的微生物群落進行了研究。Bertolini 等［39］采用Illumina 測序技術研究了意大利米蘭城區交通密集區附近TSP 樣品中的空氣微生物分布。Mazar 等［40］利用Illumina 測序技術研究了地中海東部沙塵過程對于PM10中微生物群落的影響。此外，近年來的宏基因測序技術和基因芯片技術也被用來研究空氣微生物的群落組成［21，41］。3菌Bacillus) ，葡萄球菌屬( Staphylococcus) 和假單胞菌屬( Pseudomonas) 是優勢屬。此外，微小桿菌屬Exiguobacterium和鏈霉菌屬( Streptomyces) 在珠江三角洲城市空氣中被檢測到，奈瑟氏菌屬( Neisseria meningitides也是上海城區的空氣微生物中的優勢屬。這些研究表明，70% ～ 90%的細菌都屬于革蘭氏陽性菌，與國外的一些研究相一致［45-46］。但是，Diiorgio 等［47］研究表明，基于培養方法得到的細菌其中60%以上為革蘭氏陰性菌，與大部分研究結果不同。大部分研究結果都表明革蘭氏陽性菌是空氣中主要的細菌，主要是由于它們的孢子對于大氣環境中的高太陽輻射和干燥等惡劣環境的耐受性更強［19］。總的來說，由于傳統培養方法本身的局限性，相應的研究結果可能存在很大偏差。3. 2 基于高通量測序技術高通量測序技術的通量大，可以檢測到豐度極低的微生物，明顯提高了空氣細菌的研究深度。表2 對近年來基于高通量測序技術的空氣微生物群落的一些重要研究進行了總結。由于樣品采集方法、群落解析手段及統計方法不同，導致不同研究結果的可比性較差，需要對不同研究進行分類比較。目前，關于空氣細菌的研究主要集中于以下4 個方面: 1) 空氣細菌群落的空間和時間變化; 2 ) 特殊事件對空氣細菌的影響; 3) 探究空氣細菌的主要來源; 4 )環境變量和氣象因素與空氣微生物群落的關系，下別進行綜述。表2 基于高通量測序技術的空氣細菌的群落組成Table 2 Airborne bacterial communities based on high-throughput sequencing2018 年2 月樊曉燕，等: 空氣微生物群落樣品采集、解析方法及研究進展Feb． ，20183. 2. 1 空氣細菌群落的空間和時間變化從表2 可以看出，前人主要利用454 和Illumina 技術研究了不同城市( 如美國中西部、意大利米蘭和香港等) 、不同季節、不同粒徑顆粒( PM2. 5、PM10或TSP) 、不同地理利用類型、不同海拔高度空氣中細菌的群落組成。不同地點、不能海拔高度、不同土地利用類型空氣中細菌的主要組成相近，其中，變形菌門( Proteobacteria) 、放線菌門( Actinobacteria) 、擬桿菌門( Bacteroidetes) 、厚壁菌門( Firmicutes) 門( Cyanobacteria)是空氣細菌的優勢門［14，37-38，48-49，51-52］。這些細菌大都屬于革蘭氏陰性菌，與傳統培養方法的革蘭氏陽性菌結果完全不同。但是，Bowers 等［49］的研究也表明，空氣細菌群落與不同地點土地利用方式明顯相關，放線菌門( Actinobacteria) 是農田和郊區的優勢門，而根瘤菌目( Rhizobiales) 是森林的優勢細菌。造成這種差異主要是由于不同利用方式下細菌來源不同，采樣期間細菌的來源直接決定了空氣中細菌群落的多樣性，這與Bertolini 等［39］的研究結果一致。此外，空氣細菌存在一定的季節變化。Bowers 等［37］研究發現，變形菌門是夏季細菌群落的優勢門，而厚壁菌門和梭桿菌門( Fusobacteria)是冬季細菌的優勢門。在目水平上，Pseudomonadales)、伯克氏菌目( Burkholderiales) 、根瘤菌目Rhizobiales)和鞘脂單胞菌目( Sphingomonadales) 是夏季的主要細菌，而擬桿菌目( Bacteroidales) 和Clostridiales) 是冬季優勢細菌。3. 2. 2 特殊事件對空氣細菌群落的影響對于特殊事件，如霧霾過程和沙塵過程中空氣細菌群落的研究及其與非霾天和非塵天氣的差異也是研究的重點，對于探究霧霾和沙塵天氣的形成機理及評估其影響，具有重要意義。Cao 等［21］在霧霾天氣利用宏基因組研究了PM2. 5和PM10中微生物的種群分布特征。研究表明，細菌群落組成在霧霾過程中并未發生明顯的變化，放線菌門( Actinobacteria) 、變形菌門( Proteobacteria) 、綠彎菌門( Chloroflexi) 、厚壁菌門( Firmicutes) 和擬桿菌門( Bacteroidetes) 是主要的細菌門。但是，該研究中發現了一些潛在致病菌，其相對豐度在整個霧霾過程中發生了變化。例如，發現的肺炎鏈球菌，是引發社區得性肺炎的常見菌種，其在PM2. 5和PM10中所占的比例分別為0. 012%和0. 017%，隨污染過程加重，其比例不斷升高，從0. 024%增加為0. 050%。空氣細菌群落在沙塵過程中發生了明顯變化。Mazar等［40］研究了地中海東部沙塵過程細菌群落的變化，發現芽單胞菌門( Gemmatimonadetes) 、紅桿菌綱( Rubrobacteria) 、弗蘭克氏( Frankiaceae) 和魚孢菌科( Sporichthyaceae) 是沙塵天氣的主要細菌，而在非沙塵天氣，細菌主要屬于皮菌科Dermabacteraceae) 和乳桿菌科( Lactobacillaceae) 。Polymenakou等［53］對克里特島( 希臘) 沙塵事件中空氣細菌組成的研究發現，在粗粒子中，細菌主要屬于厚壁菌門( Firmicutes) ，而在細粒子中，其逐漸被放線菌門( Actinobacteria) 所替代。Jeon等［54］的結果表明沙塵天和非沙塵天空氣細菌組成存在明顯的差異。沙塵天氣，厚壁菌門( Firmicutes) 是細菌的優勢門，在總序列中的占比高達53%，而在非沙塵天氣，細菌主要屬于變形菌門( Proteobacteria) 。3. 2. 3 空氣細菌的主要來源究空氣中細菌群落結構還可以用來預測空氣細菌的來源。前人的一些研究表明: 顆粒物中豐度最高的微生物可以作為推測空氣細菌來源的指示，并通過這些指示微生物來考察不同來源的相對貢獻［39］。但是，在細菌溯源分析中，是否將葉綠體( Chloroplast) 序列包含在序列分析中，依然是一個有爭議的問題。由于葉綠體16S rRNA 基因與細菌16S rRNA基因有一定的重合，其在高通量測序中會占據一定的比例。Brodie［55］、Fahlgren［56］、Franzetti［50］和Bertolini［39］等把葉綠體序列包含在內，主要是由于植物是空氣生物的主要來源，包含葉綠體序列對于探究空氣微生物來源具有一定的幫助。而其他一些研究，如Jeon［54］和Maron［57］等將葉綠體序列排除在外，因為葉綠體畢竟不是細菌的組成部分。Bertolini 等［39］從米蘭采集40 個顆粒物樣品，并用Illumina進行測序分析，結果表明，土壤和植物是空氣細菌微生物群落的主要來源。Bowers 等［49］的研究表明，土壤和植物落葉是空氣細菌的主要來源。除了土壤和植物外，動物糞便，尤其是狗的糞便，也是PM2. 5樣品中細菌的主要來源［37］。在大陸和溫帶地區，不同的研究都表明，植物是空氣細菌的主要來源，尤其是在溫暖的季節。Fahlgren 等［56］的研究結果表明，在溫暖季節，植物相關的細菌及葉綠體的序列在總序列中所占的比例極高，而在寒冷季節，空氣細菌只要是一些土壤相關的細菌。此外，還可以通過后向軌跡來分析空氣細菌的來源。3. 2. 4 環境變量和氣象因素與空氣微生物群落的關系空氣微生物學的另一大目標是研究影響空氣細菌群落結構的環境因子和氣象條件。目前，只有極少數研究考察了單一氣象因子的影響［52，55，58］。空氣溫度是影響不同環境微生物群落的重要影響因子。Maron 等［58］研究結果表明，溫度和相對濕度對于法國南錫城市空氣細菌群落結構季節變化的貢獻最大。Bowers 等［52］研究結果表明，溫度是空氣細菌群落結構的唯一影響因素，尤其對于春季和秋季季節間的變化的影響最大。此外，許多研究結果也表明，空氣細菌群落的空間時間變化主要是由其他一些環境變量引起的，如氣象因子( 除溫度外) 、顆粒物中的化學成和空氣微生物的主要來源［55］。因此，環境因子與空氣細菌群落結構的關系依然不清楚，還有待進一步研究。3. 3 展望針對目前研究中存在的不足，空氣微生物未來可深入研究的有以下幾方面。1) 統一采樣標準，開發更高效合理的空氣微生物采樣器，使采樣更能反映原位狀態。2) 完善空氣微生物基因組DNA 提取的方法，為后續群落鑒定提供保障。3) 空氣微生物的空間和時間變化研究。擴大空氣微生物研究范圍，如全國范圍、城市站和背景站的對比研究、不同生態功能的空氣微生物的研究等; 考察空氣微生物長時間( 如5 a、10 a) 變化規律。4) 加強特殊污染事件中空氣微生物的研究，探究霧霾形成的生物學機理，有針對性的提出治理措施。同時，有必要開展霧霾過程中潛在致病菌的研究，對于評估污染過程對于人體健康的影響具有重要作用。5) 進一步探討空氣微生物與環境因子，如溫度、相對濕度、風速、PM2. 5及其中物理化學成分和氣態污染物之間的內在聯系，初步確定空氣微生物污染的形成機制。360Vol． 18 No． 1 安全與環境學報第18 卷第1 期6) 空氣微生物的粒徑布特征尚不清楚，有必要通過多級采樣器，采集分級顆粒物，系統研究微生物的粒徑分布特征，有利于全面評估其對人體健康的危害。4 結論空氣微生物能夠導致人類及動植物疾病的傳播、工農業產品的腐爛變質，影響人體健康和經濟發展。嚴重霧霾的快速形成和擴散與其中微生物的快速繁殖密切相關，研究空氣微生物具有重要的意義。目前，相關研究還處于剛剛起步階段，仍存在許多問題: 1) 采樣技術的標準不統一，常用的采樣技術，雖對顆粒物的捕獲效率高，但在反映其原始狀態上存在一定缺陷; 2) 采集的顆粒物質量較少，很難從其中提取高質量、高濃度的DNA 樣品，在一定程度上限制了后續微生物分析的準確性; 3) 空氣微生物的研究主要集中于城市地區，研究面太窄; 4) 空氣微生物時間上的變化大多關注于其季節變化; 5) 特殊污染事件中空氣微生物的研究有待進一步加強;6) 空氣微生物與環境因子之間的關系仍不清楚。

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